13. 細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？
動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含 5 - 10 %DMSO (dimethyl
sulfoxide) 和 90 - 95 % 原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于 DMSO
稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能， 故不可將 DMSO 直接加入細(xì)胞液中， 必須使用前先行配制完
成。
14. DMSO 之等級(jí)和無(wú)菌過(guò)濾之方式為何？
冷凍保存使用之 DMSO 等級(jí)， 必須為 Tissue culture grade 之 DMSO (如 Sigma
D2650)， 其本身即為無(wú)菌狀況， 第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中， 保存
于 4°C， 避免反復(fù)冷凍解凍造成 DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì)， 并可減少污染之機(jī)
會(huì)。若要過(guò)濾 DMSO， 則須使用耐 DMSO 之 Nylon 材質(zhì)濾膜。
15. 冷凍保存細(xì)胞之方法？
冷凍保存方法一: 冷凍管置于 4℃ 30~60 分鐘→ (-20 ℃30 分鐘*) → -80
℃16~18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽 vaporphase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降 1-3 ℃ 至
–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。*-20 ℃不可超過(guò) 1 小時(shí)， 以
防止冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活
率稍微降低一些。
16. 細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)， 細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？
冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial， 融合瘤細(xì)胞則以 5x106 cells/ml
vial 為宜。
17. 應(yīng)如何避免細(xì)胞污染？
細(xì)胞污染的種類(lèi)可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因?yàn)?/p>
無(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格之無(wú)菌操作
技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。
18. 如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí)，應(yīng)如何處理？
加入相應(yīng)抗生素。直接滅菌后丟棄之。 % h7 K+ d* K' K, J
19. 支原體(mycoplasma) 污染的細(xì)胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？
不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專(zhuān)家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，無(wú)法以其外觀分
辨之。
20. 支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？
支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長(zhǎng)參數(shù)， 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)
驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為 mycoplasma-free，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。
21. CO2 培養(yǎng)箱之水盤(pán)如何保持清潔？
定期(至少每?jī)芍芤淮? 以無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去離子水更換之。
22. 為何培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中， 顏色會(huì)偏暗紅色， 且 pH 值會(huì)越來(lái)越偏堿性？
培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中， 培養(yǎng)基內(nèi)之 CO2 會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來(lái)越偏
堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為 phenol red) 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗
紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果， 將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)， 可以通入
無(wú)菌過(guò)濾之 CO2， 以調(diào)整 pH 值。
23. 各種細(xì)胞培養(yǎng)用的 dish，flask 是否均相同？
不同廠牌的 dish 或 flask， 其所 coating 的 polymer 不同， 制造程序亦不同，
雖對(duì)大部分細(xì)胞沒(méi)有太大之影響， 惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之 dish 或 flask
而有顯著之生長(zhǎng)差異。 ) Z, r* D" X+ X' W/ p' ~
24. 購(gòu)買(mǎi)之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形？
研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少， 大都是因?yàn)殡x心過(guò)程操作上的
失誤， 造成細(xì)胞的物理性損傷， 以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心， 應(yīng)
待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。
